WB、IF/ICC、ELISA用 抗Cas9 ウサギモノクローナル抗体 - Q99ZW2

中核製品仕様とパラメータ

生物学的背景：Cas9の機能と局在

• Cas9（CRISPR関連エンドヌクレアーゼ Cas9/Csn1）は、158.4 kDaのRNAガイド型DNAエンドヌクレアーゼであり、化膿レンサ球菌におけるII型CRISPR-Cas適応免疫系の酵素コアを形成します。 関連参考文献： PMID:21455174
• その本来の生物学的役割において、Cas9は、短い外来配列（スペーサー）をCRISPR遺伝子座に組み込むことにより、細菌を侵入プラスミドやウイルスDNAから保護し、配列特異的免疫のための遺伝的記憶を提供します。 関連参考文献： PMID:21455174
• Cas9は、標的DNAへの結合とヌクレアーゼ活性の両方に、2つの小さなRNA—CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化crRNA（tracrRNA）—を必要とします；これらガイドRNAが存在しない場合、触媒活性はありません。 関連参考文献： PMID:24270795 PMID:24476820
• 標的認識は、CRISPRリピート内の短いプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM; 5'-NGG-3'）によって制御され、これは自己と非自己DNAを識別する役割を果たします；PAM結合はDNA鎖の分離とヘテロ二本鎖形成を開始します。 関連参考文献： PMID:24476820
• PAM認識後、Cas9はcrRNAに相補的でない標的鎖のエンドヌクレアーゼ切断を触媒し、続いて3'-5'エキソヌクレアーゼによるトリミングが行われます；両方のヌクレアーゼ段階はマグネシウムまたはマンガンイオンに依存しています。 関連参考文献： PMID:24476820
• CRISPR RNA成熟において、Cas9は処理を触媒しません；それはpre-crRNA:tracrRNA二重鎖を安定化させ、宿主リボヌクレアーゼIIIによる正確な切断を可能にします。 関連参考文献： PMID:24270795

実験ガイダンスと技術的ヒント

• 免疫原はCas9のアミノ酸450-730にまたがり、この領域はHNHヌクレアーゼドメインとPAM相互作用ドメインを含みます。ウェスタンブロッティングでは、Cas9トランスフェクション細胞からのライセートまたは精製された組換え全長Cas9を陽性対照として使用することを検討してください；予測分子量は158 kDaです。
• 免疫蛍光/ICCでは、Cas9の局在はガイドRNAと標的によって異なる場合があります。適切な対照を用いて固定および透過処理条件を検証し、利用可能であればCas9ノックアウトまたはノックダウン細胞株を使用して特異性を確認してください。
• ELISAでは、組換えCas9フラグメントを使用して標準曲線を確立できます；ただし、定量的応用の前に、関連する生物学的マトリックスにおける内因性Cas9または他のファミリーメンバーとの交差反応性を評価してください。
• この抗体は、ヒトCas9を含め広範囲に交差反応することが予測されています。他の種からのサンプルを使用する場合は、予想される反応性を確認するための初期検証をお勧めします。

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